برداشت و حذف سريع و موثر تگ داراي ميل تركيبي (affinity tag) از پروتئين¬هاي نوتركيب به عنوان يك مشكل قابل توجه در تخليص اين پروتئين¬ها باقي مانده است كه معايبي از جمله كارآيي پايين و قيمت بالا دارد. در اين¬اختراع، يك رهيافت ساده، موثر و كم هزينه در جهت تخليص پروتئين بدون تگ ازlysate باكتري توصيف شده است. با بهره گيري از متد بسيار سريع SIRP و با استفاده از تگ رسوبي BRT به طور متصل به اينتئين مجزا،

در حال حاضر گروهي از وكتورهاي ويروسي وجود دارند كه براي ساخت واكسن هاي نوين ويروسي مورد استفاده قرار مي گيرند. در ميان وكتورهاي ويروسي، وكتورهايي متعلق به ويروس هاي RNA دار با قطبيت منفي كاربرد گسترده تري در اين زمينه دارند. براي دستكاري ويروس ها با استفاده از تكنولوژي ژنتيك معكوس وجود وكتورهاي داراي توالي هاي پروموتري خاص و بيش از يك پايان دهنده ي رونوشت برداري (HDV ريبوزيم و T7 Terminator) از اهميت بالايي برخوردار است. به همين دليل نياز به طراحي و ساخت سيستم هايي كه بتوانند از روي ژن هاي ويروسي كلون شده در وكتورهاي نوتركيب ضروري به نظر مي رسد. هدف از اين نوآوري طراحي و ساخت سيستمي است كه بتوان با استفاده از آن خاتمه رونوشت برداري ژن هاي ويروسي نوتركيب را با صحت بالا انجام داد. به همين منظور عناصر ژنتيكي ويژه از جمله T7 Terminator و HDV ريبوزيم به بنيان وكتور اضافه شد تا با وجود MCS با توالي هاي اختصاصي براي آنزيم هاي محدودالاثر امكان Sequential Cloning براي ژن هاي ويروسي با هدف به كارگيري اين سيستم در ساخت واكسن هاي نوتركيب فراهم گردد.

توليد آنزيم نوتركيب فيتازمقاوم به حرارت باكاربرد صنعتي

توسعه سيستم هاي آزمايشگاهي، جهت انجام فرآيند اسپرمزايي و توليد اسپرم در خارج از بدن موجود، براي مطالعات بنيادي و كاربردي در حيطه هاي پزشكي (مطالعات و درمان ناباروري)، بيوتكنولوژي (توليد حيوانات تراريخت) و كشف داروها اهميت بسيار بالايي دارد. در اين اختراع، با استفاده از سيستم سه بعدي آگار نرم (SACS)، شرايط كشت آزمايشگاهي فراهم آورده شده است، كه ظرفيت القاء تمايز سلول هاي ژرمي جوجه به مراحل نهايي فرآيند اسپرمزايي و توليد اسپرم را دارد. سلول هاي بافت بيضه جوجه تازه متولد شده، جدا و كشت داده شدند. وجود سلول هاي ژرمي بخصوص سلول هاي بنيادي اسپرم ساز (SSCs) در اين كشت ها، بوسيله بررسي هاي ميكروسكوپي (شكل 1) و آناليز بيان ژن ها با روش RT-PCR (شكل 2)، تاييد شد. در ادامه سلول هاي كشت شده حاصل از بافت بيضه در محيط سه بعدي طراحي شده، كشت داده شدند. بعد از 5 هفته با روش رنگ آميزي هماتوكسيلين-ائوزين و ميكروسكوپ نوري نمونه ها مورد بررسي قرار گرفتند و سلول هاي اسپرمي شناسايي شدند. بطور كلي، حاصل اين اختراع ارائه يك سيستم بسيار ساده، تكرارپذير و كارآمد جهت توليد سلول هاي اسپرمي كاملا بالغ از لحاظ مورفولوژي از سلو لهاي بنيادي اسپرم ساز جوجه مي باشد (شكل 3).

اين اختراع در رابطه با چگونگي ساخت DNA واكسن هاي بيان كننده فرم هاي تغييريافته آنتي ژن H5 از يك ويروس آنفلوانزاي فوق حاد پرندگان و روش استفاده از آن براي القا و ارتقاي پاسخ هاي ايمني همورال و سلولي بر عليه ويروس آنفلوانزاي فوق حاد پرندگان در مدل موشي BALB/c مي باشد. اختراع حاضر شامل ساخت دو پلاسميد DNA بيان كننده فرم داخل غشايي و فرم ترشحي H5 مي باشد. براي افزايش ايمني زايي، هر دو فرم آنتي ژن به صورت متصل به 4 كپي از پپتيد ادجوانتي P28 بيان مي شوند. توالي كد كننده H5 در اين DNA واكسن در مقايسه با سويه وحشي ويروس داراي سه نوع تغيير مي باشد. كدون هاي كد كننده ژن H5 به گونه اي تغيير داده شده اند كه بيشترين ميزان بيان و توليد آنتي ژن را در سلول هاي پستانداران داشته باشند. ناحيه شكست آنزيمي بين دو زير واحد HA1 و HA2 به جهت بي خطر نمودن واكسن حذف شده است. تغيير آخر مرتبط با حذف دومن داخل غشايي پروتئين وحشي و ايجاد فرم ترشحي H5 مي باشد. واكسن اختراع شده را مي توان در مقايسه با واكسن هاي كشته و زنده تخفيف حدت يافته با سرعت بالاتر و هزينه كمتر براي مقابله با سويه هاي نوظهور ويروس آنفلوانزا توليد كرد.

تكنولوژي شبح باكتريايي با هدف توليد واكسن و ابزار تحويلي براي انواع بيماري هاي باكتريايي و ويروسي، تركيبات دارويي و ضد سرطاني گسترش پيدا كرده است. ايجاد شبح باكتريايي از باكتري هاي گرم منفي نيازمند بيان كنترل شده ژن E-Lysis است. وكتور ابداع شده در اين كار pmET32c نام دارد كه داراي ژن مقاومت به جنتامايسين و ژن هاي E-Lysis و SNUC بوده كه بيان اين دو ژن به ترتيب تحت كنترل مهاركننده CI857 و LacI هستند. القاي بيان اين دو ژن با افزايش دما و افزودن IPTG صورت مي گيرد. افزودن ژن S نوكلئاز در فرآيند توليد شبح باكتريايي اهميت بالايي دارد چون با عملكرد آنزيمي خود منجر به حذف كليه اسيدهاي نوكلئيك شده و از خطر انتقال ترانس ژن ها به ميزبان پيشگيري مي نمايد. با بيان ژن هاي E-Lysis و S نوكلئاز، باكتري مورد نظر به شبح باكتريايي تبديل مي شود كه كليه محتويات سيتوپلاسمي خود را از دست داده و DNA آن با هضم آنزيمي از بين رفته و پوسته باقي مانده باكتري داراي مورفولوژي سالم است كه قابليت تحريك پاسخ هاي ايمني را در ميزبان دريافت كننده دارد. همچنين امكان بيان و خالص سازي آنزيم نوكلئاز اين وكتور به تنهايي براي استفاده در مهندسي ژنتيك وجود دارد.

بيماري نيوكاسل در پرندگان مسري است و خسارات اقتصادي مهلكي در صنعت مرغداري ايجاد مي كند. در جهان سويه‌هاي لنتوژنيك NDV از قبيل Hitcher B1 و LaSota به شكل گسترده استفاده مي‌شود. اما مطالعات نشان داده است كه واكسن همولوگ حاصل از يك ژنوتيپ خاص با همان ويروس دخيل در همه¬گيري، موجب كاهش معني‌دار اين بيماري مي‌گردد. براي ساخت واكسن هاي جديد برمبناي ژنوتيپ هاي رايج از روش ژنتيك معكوس استفاده مي شود. در اين روش cDNA كامل ژنوم ويروسي كلون شده و به همراه سه وكتور كمكي P، L و NP ويروس نوتركيب در سلول¬هاي ميزبان بازيابي مي شود. در اين اختراع، از روش BioBrick به منظور ساخت سازه هاي ژني مورد نياز در ژنتيك معكوس استفاده شد كه در آن با استفاده از آنزيم هاي برشي SalI، AsisI و PacI قطعات ژني مختلف ژنوم NDV برش داده شده و با استراتژي جديد Asis-Sal-Pac-BioBrick ژنوم كامل NDV با رعايت اصل "rule of six" ساخته شد. موتاسيون مستقيم ناحيه برشي ژن F از موتيف 112RRQKRF117 به 112GRQGRI117 جهت تخفيف حدت ويروس تغيير يافت كه تمامي مراحل ساخت ژنوم كامل ويروس و وكتورهاي كمكي با تعيين توالي مورد تاييد شد.

در محيط هاي بسته پس از آزاد شدن گازهاي خطرناك همانند گازهاي متان و دي‌اكسيدكربن و افزايش بيش از حد اين گازها و رسيدن به ميزان بحراني، گيرنده هاي دستگاه تشخيص داده و بلافاصله جهت جلوگيري از بروز هرگونه حادثه، برق و گاز توسط برد اصلي و رله متصل به آن قطع گرديده و سپس سيستم تهويه فعال مي شود. سيستم هشداردهي فعال شده و پس از آن به مراكز آتش نشاني، اورژانس، پليس با استفاده از سيستم نرم افزاري دستگاه و پيامك اطلاع داده و يك سيستم تماما هوشمند تهويه را به ارمغان مي آورد.

كولي باسيلوز طيور يك بيماري شايع، سيستميك و با پراكنش جهاني است كه ضررهاي اقتصادي فراواني به صنعت طيور وارد كرده و بيشترين فراواني را در ابتلا و مرگ‌ومير دارد. اين عفونت توسط سويه¬هاي پاتوژنيك باكتري اشرشيا كلي (APEC) ايجاد مي¬گردد. استراتژي‌هاي درماني شامل كنترل و نظارت بر روي عوامل زمينه‌ساز عفونت، تجويز آنتي‌بيوتيك و استفاده از واكسن هاي ساخته شده موجود عليه اين بيماري مي¬باشد. متأسفانه به علت مصرف بي‌رويه آنتي‌بيوتيك، سويه‌هاي مقاوم به يك يا چند آنتي‌بيوتيك‌ ايجاد شده¬اند. واكسن¬هاي موجود شامل واكسن كشته، واكسن تخفيف حدت يافته و واكسن نوتركيب است كه هر كدام داراي معايبي بوده و هيچ‌كدام نمي‌توانند مصونيت كامل در برابر اين بيماري ايجاد نمايند. هدف اين اختراع معرفي نوعي واكسن فاقد اسيدنوكلئيك با استفاده از فناوري شبح باكتريايي (BGs) عليه باكتري APEC سويه O78K80 مي¬باشد كه در فرمانتور نيمه صنعتي توليد شده است. واكسن كانديد O78K80 BGs توان تحريك سيستم ايمني ميزبان با افزايش پاسخ¬هاي ايمني ذاتي و اكتسابي و كاهش ميزان ضايعات كالبدگشايي در جوجه¬هاي ميزبان را دارد. بنابراين مي¬توان ادعا كرد فناوري شبح باكتريايي امكان توليد واكسن¬هاي -پلي والان بر عليه سويه¬هاي در گردش و شايع APEC در منطقه، ايران و ساير كشورها را فراهم مي¬نمايد.

اصلاح ژنتيكي به‌صورت هدفمند و با كارايي بالا دغدغه امروز درمان بيماري‌هاي ژنتيكي است. تكنيك‌هاي موجود كارايي پايين داشته و به‌صورت هدفمند عمل نمي‌كنند كه در برخي موارد منجر به سميت سلولي و فعال شدن پروتوانكوژن مي‌شود. همچنين محدوديت‌هايي در ميزان كارايي تعويض ژني و سيستم‌هاي ترميمي DNA وجود دارد. ترانسپوزاز Piggybac از سيستم آنزيمي با كارايي بالا براي واردكردن ژن خارجي در ژنوم به‌صورت تصادفي استفاده مي‌كند. در اختراع حاضر، پروتئين dcas9 به ترانسپوزاز Piggybac به همراه يك لنگر متصل شده و از يك duel sgRNA براي هدايت هدفمند ورود قطعه خارجي به ناحيه موردنظر استفاده شد. با بهره‌گيري از روش dCas9-PB تغييرات ژنتيكي در جهت فعال كردن گزارشگر DsRed2 با واردكردن پروموتور در محل اختصاصي HROSA26 به‌صورت هدفمند انجام شد. نتايج به‌دست‌آمده نشان مي‌دهد روش پيشنهادي با كارايي مناسب توان ورود ژن خارجي را به ناحيه ژني اختصاصي دارد. عملكرد اختصاصي اين روش مي‌تواند قابليت استفاده براي درمان سلول‌هاي سرطاني در جهت واردكردن قطعه ژني به‌منظور تخريب ژن‌هاي سرطاني و يا قرار دادن پروموتور قبل از ژن‌هاي مهاركننده تومور براي فعال كردن آن‌ها را دارد.